El nacimiento de la electrofisiología y la biofísica modernas se sitúa en la primera medición de la velocidad de propagación de una señal nerviosa. Este fue el fruto del trabajo del investigador alemán, físico, fisiólogo y matemático, Hermann von Helmholtz. Impulsado por su maestro Johannes Muller, quien paradojalmente no creía en la posibilidad de resultados en esta área, y en colaboración con su colega fisiólogo Emil Du Bois-Reymond, Helmholtz hizo importantes aportes a las investigaciones en bioelectricidad.
Hermann von Helmholtz: Un Pionero en la Neurofisiología
Uno de los colaboradores del célebre fisiólogo Emile Du Bois-Reymond (a quien se le debe el descubrimiento del potencial de acción en la excitación nerviosa), y que fue también alumno de Johannes Müller, fue el fisiólogo y físico Hermann von Helmholtz. Hermann Ludwig Ferdinand von Helmholtz nació en 1821, en Potsdam. Era el hijo mayor de un maestro de literatura y filología en la escuela secundaria de la ciudad. Hermann sintió rápidamente una inclinación por la física, pero la precaria situación económica familiar le hizo aceptar una beca para estudiar medicina en el Kónigliches Medizinisch-Chirurgisches Friedrich-Wilhelm Institut en Berlín, lugar donde ingresó en 1838. Esta beca le significaba el compromiso de trabajar como médico militar, lo que hizo entre 1843 a 1848, en un regimiento en su ciudad natal, Potsdam.
La Carrera de Helmholtz
Durante su estadía en el instituto de medicina, Helmholtz se convirtió en uno de los estudiantes de Johannes Müller, ingresando a su vez a la recientemente fundada Sociedad Física de Berlín. Con Müller investigó el origen de las fibras nerviosas que se derivan a partir de las células ganglionares. Además, hizo estudios sobre la llamada "fuerza vital", un tema que en aquel tiempo atraía la atención de físicos, químicos y biólogos; el resultado fue un trabajo de física que apareció en 1847, Uber die Erhaltung der Kraft, en el cual aplicó el principio de conservación de la energía descrito por Robert Mayer (1814-1878) y James Joule (1818-1889) a otras áreas de la ciencia, incluida la fisiología. En 1848 Helmholtz comenzó a dar clases en la Academia de Artes de Berlín y un año más tarde fue nombrado Profesor de Fisiología y Anatomía Patológica en la Universidad de Kónigsberg. Aquí realizó su famoso experimento sobre la velocidad del impulso nervioso.
En 1858 se cambió a Bonn como Profesor de Anatomía y Fisiología y, en 1868, a Heidelberg como Profesor de Fisiología. En 1871 ocupó la cátedra de Física en Berlín. Helmholtz fue miembro de las academias y sociedades científicas más importantes de su tiempo y en 1882 el Kaiser Wilhem I lo elevó a la nobleza, con lo cual su nombre cambió a von Helmholtz. Fue, además, Presidente del recientemente fundado Physikalisch-Technische Reichsanstalt de Berlín, lugar en el que permaneció hasta su muerte.
Helmholtz murió en Berlín, en 1894, a la edad de 73 años. Las contribuciones de Helmholtz, quien nunca estudió física y matemática formalmente, han tenido impacto en todos los campos de la ciencia y son reconocidas ampliamente.
La Velocidad de Propagación del Impulso Eléctrico
La breve comunicación de dos páginas en que Helmholtz reporta la velocidad de conducción nerviosa puede ser considerada el punto de partida de la neurofisiología y biofísica modernas. Los primeros fisiólogos, incluyendo su maestro Johannes Müller, creían que la función de los nervios era servir como base para la propagación de un agente inmensurable, el llamado "espíritu animal". Más aún, Müller sostenía que nadie sería capaz de medir la velocidad de la acción nerviosa, ya que los tiempos involucrados eran demasiado pequeños. En su trabajo de 1850, Helmholtz estableció que el tiempo necesario para que se propague la excitación de un nervio por una breve corriente eléctrica, desde el plexo sacro hasta la inserción del nervio tibial en el músculo gas-i (en la rana), era finito. En enero de 1850, Helmholtz envió este informe a su amigo y colega Du Bois-Reymond, con la petición de que lo enviara a la Sociedad de Física en Berlín a fin de "depositarlo en su archivo y salvaguardar la prioridad". Johannes Müller presentó el estudio de Helmholtz como el primero realizado por el grupo físico-matemático de la Kóniglich-le Akademie der Wissenchaften, de Berlín.
El experimento de Helmholtz estableció que la velocidad de conducción nerviosa era de entre 25 y 43 m/s, un resultado extraordinariamente preciso y muy cercano a lo que establecen las mediciones hechas con las técnicas actuales. En una investigación siguiente, Helmholtz se refiere a la importancia de la temperatura en la velocidad de conducción nerviosa. Menciona que obtuvo los valores más bajos de la velocidad cuando los nervios estaban fríos, un hecho que habla de la manera exacta y crítica con que trabajaba.
Es interesante notar que las refinadas técnicas que Helmholtz usó eran una consecuencia de la tecnología desarrollada por el militarismo prusiano. Un problema importante para la artillería de la mitad del siglo XIX era calcular la trayectoria de una bala de cañón, para lo que era necesario conocer su velocidad y el tiempo requerido para que la pólvora prendiera. En una conferencia, el 13 de diciembre de 1850, Helmholtz narra la historia de las mediciones de pequeños intervalos de tiempo. En ella describe los instrumentos empleados, en particular, el cilindro rotatorio de Siemens, que permitía resolver hasta 40 milésimas de segundo, y el aparato de Foucault y Fizeau -ellos lo usaron para medir la velocidad de la luz- y con el cual se podía medir hasta 77 millonésimas de segundo. Finalmente, recalcó: "... ustedes ven como la microscopía del tiempo ha sobrepasado por mucho a la del espacio".
El trabajo de Helmholtz sobre la velocidad de conducción en el nervio no terminó con el informe de 1850, publicando una versión completa sobre el tema en 1852.
Evaluación de los Efectos de Diversas Intensidades de Estimulación Nerviosa
La amplitud de respuesta en segmentos de nervios es producto de los potenciales de acción compuestos resultantes a la estimulación eléctrica. En esta investigación se estudió el comportamiento nervioso a potenciales evocados *in vivo* en humanos (nervio ulnar) e *in vitro* como nervio aislado en *Bufus marinus*. Durante la estimulación de los nervios se encontró respuesta de comportamiento cualitativo creciente y heterogéneo intra e ínter-especie.
Las fibras de diámetros diferentes que forman un nervio generan potenciales de acción individuales que se suman para dar un potencial de acción compuesto que corresponde a la amplitud de respuesta del total de fibras de un nervio con diferentes velocidades de conducción. La caracterización de las respuestas a la estimulación nerviosa para un nervio aislado compuesto de una morfología neuronal heterogénea debe entenderse ya no como subumbral, umbral y supraumbral para una sola neurona (siendo el umbral nervioso la intensidad de estímulo necesario para provocar la activación de una neurona expresada como potencial de acción), sino más bien como estimulo-respuesta submaxima, máxima y supramaxima para un nervio compuesto por muchas neuronas. Se entiende que un estímulo submaximo es subumbral para algunas fibras no activadas por el potencial eléctrico evocado y umbral y/o supraumbral para las fibras del nervio activadas.
Las evaluaciones de excitabilidad y conductividad de potenciales de acción compuestos pueden realizarse directamente sobre un nervio (aislado o *in situ*) o mediante inferencias como en el caso de la mayoría de las evaluaciones de neuroconducción motora realizada en humanos con fines clínicos. El estudio del potencial de acción compuesto en nervio aislado, ofrece como ventaja el que las respuestas eléctricas son obtenidas directamente del nervio activado, por tal motivo, esta observación directa permite análisis más específicos relacionados con la función neuronal.
Factores que Influyen en la Amplitud de la Respuesta
La amplitud de las respuestas electrofisiológicas de órganos completos, en general, dependen de:
- El número de fibras que componen el órgano.
- La sincronización de la respuesta.
- La resistencia eléctrica entre el órgano activado y los electrodos de registro.
- Del componente vectorial registrado en el potencial de campo.
- De las propiedades de los instrumentos de registro.
De esta forma, si se evalúa de manera consecutiva las respuestas eléctricas musculares o nerviosas en un montaje experimental donde no cambien de ubicación los electrodos de estimulación y los de registro ni las propiedades del equipo de registro, las variaciones en las amplitudes de las respuestas dependerán esencialmente del número de fibras activadas en el órgano blanco y de la sincronización de las mismas.
Metodología Experimental
La electroestimulación y evaluación de la respuesta eléctrica se realizó mediante el equipo PowerLab 16/30, el cual permitió visualizar y cuantificar tanto los parámetros de la estimulación nerviosa como los parámetros en tiempo y voltaje de la respuesta nerviosa. El equipo además permitió el almacenamiento de los registros. Para la estimulación y registro de nervio ciático aislado el procedimiento requirió electrodos de estimulación y registro que se conectaron al equipo en los canales 0 y 1 respectivamente. Los terminales de estimulación y registro se acoplaron a una "cámara para nervio aislado" con solución Ringer-Sapo por debajo del nivel de los electrodos. Para los potenciales evocados EMG del nervio ulnar en humanos, se utilizó adicionalmente una unidad de aislamiento conectada al amplificador principal.
Procedimiento en Humanos
Se realizó electro-estimulación y evaluación de la respuesta electromiografica a la estimulación progresiva creciente del nervio Ulnar durante su trayecto posterior del epicondilo medial del humero. Los electrodos de registro EMG se ubicaron sobre la eminencia hipotenar en donde la mayoría de los miotomas del nervio ulnar se representan. Se evaluaron seis valores de intensidades de estímulos aplicados (10, 12, 14, 16, 18 y 20 mA) de forma aislada. Cada estímulo tuvo una duración de 2 ms. Cada intensidad fue repetida 3 veces con el fin de evaluar reproducibilidad de los resultados dentro de cada preparación experimental.
Procedimiento en *Bufo marinus*
Cada nervio fue cuidadosamente disecado y montado en una cámara de nervio aislado bajo ambiente humedecido con una solución Ringer-Anfibio. Se evaluaron 35 valores de intensidades de estímulos aplicados de forma aislada (de 80 a 410 mV) y creciente. Cada estímulo tuvo una duración de 2 ms. Cada intensidad fue repetida 3 veces con el fin de evaluar reproducibilidad de los resultados dentro de cada preparación experimental. El control negativo para este procedimiento se obtuvo al impregnar con epinefrina el nervio, obteniéndose el bloqueo de este y el silencio en los electrodos de registro.
Tomando en consideración la variabilidad individual de cada muestra examinada, se procedió a normalizar los valores de cada variable y cada individuo por el máximo valor de su propia respuesta. Se utilizó el promedio de las 3 medidas de cada intensidad para la representación final de los resultados de cada nervio. Se hizo un análisis de correlación y se encontraron los mejores ajustes a funciones logarítmicas y/o lineales entre las variables examinadas.
Resultados Experimentales
La electroestimulación se realizó en cuatro nervios ulnares de humano y cinco nervios aislados de *Bufo marinus*. La amplitud de respuesta representado como área bajo la curva para los nervios aislados ciáticos de *Bufo marinus* y humanos, mostraron respuestas crecientes de amplitud bajo estímulos submáximos y una estabilización de las respuestas (saturación) bajo estímulos máximos. Se observó una relación lineal entre área bajo la curva (carga movilizada) y la amplitud máxima. Cada una de las respuestas a estímulos crecientes presentó una dispersión importante en todos sus valores de amplitud de respuesta.
Las velocidades máximas de repolarización del nervio aislado tienen la tendencia a ser mayores y ajustan significativamente a una tendencia logarítmica (sapos R2=0.9832, humanos R2=0.0.992). Las respuestas de amplitud neuronal a estímulos escalonados aunque heterogéneo intra e ínter-especie se expresa de manera creciente y predecible en sentido cualitativo.
Cuando se relacionan la máxima amplitud de respuesta y el área bajo la curva de la misma se puede observar como las máximas amplitudes de respuesta tienden igualmente a "saturarse" mientras que el área bajo la curva aún puede continuar incrementando. La amplitud de respuesta en iguales nervios del mismo espécimen (ipsi y contralateral) mostraron respuestas de amplitud diferentes.
Discusión
Durante la estimulación de los nervios se encontró respuesta de comportamiento cualitativo creciente y heterogéneo intra e ínter-especie. Los mecanismos que participan en las variaciones de la amplitud (picos máximos y áreas bajo la curva) de las respuestas neuronales y musculares frente a diversas intensidades de estimulación son complejos y multifactoriales.
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