El cáncer de mama ocupa el tercer lugar en frecuencia del total de pacientes con cáncer en el mundo y más de seiscientos mil nuevos casos se informan cada año. En países en desarrollo es el segundo cáncer más común.
En Chile aún no se ha determinado su real incidencia, ya que no se ha establecido la notificación obligatoria de esta enfermedad. El artículo de Peralta et al, 1995 informa que el cáncer de mama representa la tercera tasa de mortalidad, luego del de vesícula biliar y del gástrico, sobrepasando la del cáncer de cuello uterino.
La mortalidad debida a cáncer de mama ha ido aumentando, desde 9,5 muertes por 100.000 mujeres en 1985 a 12,8 por 100.000 mujeres en 1995.
La sobrevida del cáncer de mama ha aumentado considerablemente en los últimos 30 años, lo que se atribuye al diagnóstico precoz, gracias al uso de la mamografía. Aunque este examen es útil en el cáncer de mama ya establecido, no permite identificar la población en riesgo.
En consecuencia, uno de los mayores desafíos de la investigación clínica actual es identificar las modalidades de prevención que permitan la reducción de la morbilidad y mortalidad asociadas a un alto riesgo a desarrollar cáncer de mama.
Son factores de riesgo para el desarrollo de este cáncer: edad, factores hormonales e historia familiar (predisposición genética), siendo este último uno de los más importantes. Existen informes que datan del año 1951 en los archivos médicos del Instituto Curie, que ejemplifican la relación entre historia familiar y desarrollo del cáncer de mama.
Se ha estimado que la predisposición genética es responsable de 5-10% de todos los cánceres de mama y de aproximadamente 25% de los casos diagnosticados antes de los 30 años. Una mujer con un pariente en primer grado con cáncer de mama, tiene un aumento en el riesgo de desarrollarlo. El riesgo es aún mayor si más de un pariente en primer grado ha presentado la enfermedad, o si el pariente la ha desarrollado a edad temprana, o si el cáncer ha sido bilateral. En consecuencia, es muy importante que se realice una estimación lo más exacta posible del riesgo, en mujeres con historia familiar de cáncer de mama.
Las características de la predisposición genética incluyen herencia autosómica dominante, alta penetrancia (es decir el riesgo de cáncer de mama para una mujer portadora está en el rango de 67% a los 70 años y de 80% a los 80 años), frecuencia génica de 0,003 y frecuencia de portadoras de 0,0067,8. Considerando los datos anteriores 1 en 20 mujeres con cáncer de mama es portadora de predisposición genética y en la población general lo sería 1 de cada 200 mujeres. Estas frecuencias hacen que el cáncer de mama sea una de las patologías hereditarias de más amplia distribución.
Entre los genes, cuyas alteraciones se han asociado con alto riesgo para el desarrollo de cáncer de mama están los genes supresores de tumores BRCA1 y BRCA2, aproximadamente 90% de los cánceres de mama hereditarios presentan mutaciones en estos genes.
Las mutaciones en otros genes de susceptibilidad, tales como p53, ATM, PTEM o MSH2, MLH1, PMS1, PMS2, MSH3 y MSH6 también pueden conferir predisposición al desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, estos genes son responsables de sólo una pequeña proporción de los cánceres de mama no asociados a BRCA1 o BRCA2.
Recientemente, se ha sugerido la existencia de un tercer gen de susceptibilidad para cáncer de mama, BRCA3, y se han realizado estudios de ligamiento con los locus 8p12-22 y 13q21. Los resultados obtenidos por el Breast Cancer Linkage Consorting (2002), en una gran serie de familias, no encontraron contribución significativa del locus 8p12-22, ni ligamiento con 13q21. En consecuencia, BRCA3 aún no se ha identificado.
La localización cromosómica de BRCA1 y BRCA2 se logró mediante análisis de ligamiento en familias con múltiples casos de cáncer de mama. En 1994, Miki et al13, identificaron BRCA1 mediante clonamiento posicional en 17q12-21. En ese mismo año se ubicó BRCA2 en 13p12-1314. BRCA1 posee 22 exones en 89 kb de DNA genómico, los que transcriben un RNAm de 7,8 kb, el que traduce una proteína de 1863 aminoácidos. BRCA2 tiene 10.443 nucleótidos y 26 exones distribuidos en 70 kb de DNA genómico. El gen codifica por una proteína de 3.418 aminoácidos15,16.
En BRCA1 y BRCA2, se ha descrito un alto número de mutaciones asociadas a la enfermedad, las que dan cuenta de 45% y 35% respectivamente de los cánceres de mama heredados. En mayo de 2000 la base de datos del Breast Cancer Information Core (BIC), central de datos establecida por el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano (NHGRI, USA), incluía 1.070 variantes diferentes en BRCA1 y BRCA2 de las cuales 664 estaban asociadas con efectos deletéreos. En BRCA1 49% son mutaciones que producen cambios en el marco de lectura y 66% de éstas son causantes de cáncer. En BRCA2, las mutaciones que producen cambios en el marco de lectura corresponden a 35% y 43% de ellas son responsables de desarrollo de cáncer.
La base de datos del BIC indica que las mutaciones con el mayor número de registros son: a) deleción de AG en el codón 185 del exón 2 del gen BRCA1 (185delAG) con 359 registros; b) la inserción de C en el codón 5382 del exón 20 del gen BRCA1 (5382insC) con 200 registros y c) la deleción de una timina en el codón 6174 del exón 11 del gen BRCA2 (6174delT) con 135 registros.
En Chile se han iniciado los estudios genético-moleculares para identificar las mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 asociadas a enfermedad en su población. Trincado et al (1999)17 realizaron un screening de la mutación 185delAG en 15 pacientes con cáncer de mama familiar y en 40 pacientes con cáncer de mama esporádico, sin lograr detectar dicha deleción en el grupo analizado.
Objetivo
El objetivo del presente trabajo fue determinar la prevalencia de la mutación 185delAG en 382 mujeres chilenas sanas, con al menos dos parientes con cáncer de mama.
Pacientes y Métodos
La muestra incluyó 382 mujeres chilenas sanas que participaron en la primera campaña de prevención del cáncer de mama, organizada por la Corporación Nacional del Cáncer (CONAC). El rango etario de la muestra fluctuó entre 20 y 80 años (x=45,8). Los criterios de inclusión fueron: a) mujeres sanas sin diagnóstico de cáncer de mama; b) edad no inferior a 20 años; c) acreditar dos o más familiares afectados con cáncer de mama de un mismo linaje (misma línea familiar materna o paterna), lo que fue comprobado mediante certificado médico y/o de defunción. Todas las participantes firmaron un consentimiento informado, en el que se explicaban los objetivos del estudio y la confidencialidad de los resultados.
Extracción de DNA de sangre periférica
A cada mujer incorporada al estudio se le extrajeron 7 ml de sangre periférica utilizando tubos al vacío con EDTA como anticoagulante. El DNA genómico total se obtuvo utilizando el método de Chomczinsky et al (1997)18 con modificaciones, luego de lo cual se midió densidad óptica a 260/280 nm, para establecer la concentración de DNA y el grado de pureza.
Análisis de la mutación 185delAG
Para detectar la mutación 185delAG se utilizó la técnica de mismatch PCR que consiste en cambiar una base en uno de los partidores de modo de generar un fragmento que difiere en una base respecto del DNA templado. A consecuencia de lo anterior, el producto de PCR del alelo normal adquiere un sitio de restricción que no está presente en el alelo mutante. Las amplificaciones se realizaron en 50 µl de reacción conteniendo 200 ng de DNA genómico, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 40 pmoles de cada partidor, y 1,5 U de Taq polimerasa. Se utilizaron los partidores y las condiciones de amplificación descritas por Abeliovich et al, 199719. Los productos de PCR fueron digeridos con la endonucleasa de restricción HinfI durante dos horas a 37°C. Para detectar la presencia de la mutación se utilizó electroforesis en geles de agarosa al 2%, en los cuales se cargó una muestra del amplificado sin digerir y una segunda muestra del amplificado digerido con HinfI de cada individuo. Los geles se corrieron en tampón TBE a 5V/cm2; al finalizar la corrida se tiñeron con bromuro de etidio y se obtuvo registro fotográfico. La técnica usada genera dos bandas de 150 pb y de 20 pb para el alelo normal y sólo una de 170 pb para el alelo mutado, pues la enzima de restricción no corta el producto amplificado si está presente la mutación. La banda de 20 pb no la discrimina un gel de agarosa al 2%. Como control positivo se utilizó una muestra mutada gentilmente donada por la Dra. Sabine Pages, Instituto Curie, París, Francia.
La Figura 1 muestra un esquema de la técnica de mismatch PCR, con los fragmentos que se obtienen al digerir con HinfI el amplificado por PCR del sector que incluye al exón 2 del gen BRCA1.
La confirmación de la mutación 185delAG fue realizada por: a) amplificación del exón 2 del gen BRCA1 y separación de los productos de PCR en geles denaturantes de poliacrilamida, b) Hibridación Alelo Específica (ASO) y c) secuenciación directa.
Amplificación por PCR del Exon 2 del Gen BRCA1
Las amplificaciones se realizaron en 50 µl de reacción conteniendo 200 ng de DNA genómico, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 0,2 mM de cada dNTP, 50 pmol de partidores (5' GAA GTT GTC ATT TTA TAA ACC TTT, 5' TGT CTT TTC TTC CCT AGT ATG T) y 1,5 unidades de Taq polimerasa. Los ciclos termales se iniciaron con 3 min de denaturación a 94°C, seguidos por 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min a 55°C y 1 min a 72°C y 10 min extensión final a 72°C. Para comprobar que la amplificación fue exitosa, 10 µl del producto se sometieron a electroforesis en geles de agarosa 2,0%, utilizando Ladder 100 pb como marcador de peso molecular.
Electroforesis en geles denaturantes de acrilamida-bisacrilamida
Para detectar la mutación 185delAG, 2 µl del producto de amplificación del exón 2 del gen BRCA1 se sometieron a electroforesis en geles denaturantes de acrilamida-bisacrilamida al 5%, utilizando Ladder 25 pb como marcador de peso molecular. La corrida se efectuó a 1800 V por 120 min y los geles se tiñeron con plata para visualizar los amplificados.
Hibridación Alelo Específica (ASO)
La técnica de hibridación alelo específica consta de las siguientes etapas: a) Transferencia del DNA a soporte sólido mediante la técnica de Dot Blotting Los productos de PCR fueron transferidos a membranas de nylon Z-probe GT, utilizando la técnica de DNA Dot Blotting. La transferencia se realizó en un aparato de Dot Blott de 96 pocillos, en el que se colocó una membrana de tamaño adecuado, previamente humedecida por inmersión durante 10 min en una solución 0,4 M Tris-HCl (pH 7,5). A cada pocillo se transfirieron 50 µl de una mezcla que contenía 5 µl del producto de PCR y 55 µl de 0,4 M NaOH, 25 mM EDTA pH 8,0 (Solución Denaturante), luego de lo cual se aplicó vacío para transferir las muestras al filtro. Una vez finalizada la transferencia, la membrana se envolvió en papel absorbente y se incubó a 80°C durante 30 min. Las membranas se pueden guardar en bolsas de hibridación, en oscuridad. b) Marcación del oligonucleótido en el extremo 3'0H con digoxigenina-11-dd UTP Para la identificación de la mutación 185delAG se utilizó el oligonucleótido AAAATCTTAGTGTCCCATC que tiene la deleción AG y que hibrida con la secuencia mutada. El oligonucleótido se marcó en el extremo 3'0H con digoxigenina-11-dd UTP de acuerdo al protocolo recomendado por los proveedores (Boehringer Mannheim). La marcación se realizó en 20 µl de reacción que contenían 5 pmol/ul de oligonucleótido, 5 mM CoCl2, 0,05 M de digoxigenina-11-dd UTP, 2,5 unidades de transferasa terminal y 1x de buf...
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